Ricerca Scientifica

Le ricerche sui biosensori comprendono da un lato l’impiego di tecnologie avanzate nel campo della microelettronica, dell’elettrochimica, dell’ottica, dell’acustica, della meccanica; dall’altro, l’utilizzo di migliorate tecniche di sintesi chimica e di nuove importanti tecnologie quali le ingegnerie molecolare, proteica e genetica per l’ottenimento di “biosensing materials” con molteplici proprietà e quindi utili per numerose differenti applicazioni. Oggi il trend è quello di combinare queste discipline per raggiungere uno scopo comune in quanto la loro unione può essere sinergica e portare soluzioni i.htmlettate e originali. Un buon esempio della cosiddetta “rivoluzione tecnologica” è la convergenza tra la conoscenza dell’ uso del computer, materiali intelligenti e la genomica applicata per creare il settore emergente della tecnologia biosensoristica. Per questo EcoBioServices, che negli anni ha stretto rapporti di partnership con centri di ricerca di eccellenza in vari settori, si concentra sulla ricerca di nuove soluzioni e nuovi campi di applicazione nel settore della biosensoristica con progetti specifici e collaborazioni.

Così facendo EcoBioServices si adegua al crescente interesse mostrato per il settore dalla Comunità Europea ed internazionale insieme alla dilatazione della complessita’ e della varieta’ dei temi ed alla diversificazione delle tecnologie applicate. Non a caso attualmente i biosensori sono inseriti in numerosi Progetti di Ricerca in differenti aree (Biotecnologie, Medicina, Ambiente, Tecnologie Alimentari) per risolvere problemi analitici di sicurezza, monitoraggio e controllo di processo. Ecobioservices si rende disponibile a soddisfare le esigenze dei clienti anche attivando linee di ricerca ad hoc per risoluzioni di problemi specifici. I biosensori prodotti da EBSR trovano applicazione nell’ambito del monitoraggio e nella rilevazione di agenti inquinanti presenti nelle acque, nel terreno nell’aria ed anche nel campo della salute umana mediante tecniche di screening. I biosensori sono in grado di misurare selettivamente analiti di varia natura, fornendo dati quantitativi in tempi brevi.

Progetti di Ricerca

Un biosensore pronto all'uso

Sensori stampati a base di grafite sono stati modificati per ottenere un dispositivo monouso capace di determinare la presenza , in campioni reali, di composti inibitori della fotosintesi clorofilliana, quali erbcidi e metalli pesanti La misura si basa sulla valutazione, effettuata per via elettrochimica, dell'attività del fotosistema II (PSII) un complesso proteico presente negli organismi fotosintetici e coinvolto nel processo della fotosintesi clorofilliana. A tale scopo gli elettrodi sono stati modificati attraverso l'immobilizzazione di membrane tilacoidali da pianta di spinacio, che contengono PSII.


Veloce

L'integrazione del biosensore con la cella opportuna permette di eseguire il test di misura utilizzando soltanto 50 µL di campione ed in soli 10 minuti.

Monouso

Dopo ogni misura, il biosensore può essere facilmente sostituito con uno nuovo. Questo permette di superare i problemi relativi alla contaminazione tra campioni diversi.

Semplice

L'analisi è semplice da eseguire in quanto sfrutta un protocollo molto semplice.

Principio di misura

L'illuminazione della superficie elettrodica, ottenuta attraverso un LED ad elevata intensità, attiva la reazione di trasferimento elettronico promossa dal complesso PSII.

La corrente registrata è correlata con l'attività fotosintetica. Può essere così calcolata la percentuale di inibizione di un campione attraverso la seguente formula: [(Iblank-Isample)/ Iblank] * 100 dove Iblank è il valore di corrente che si ottiene analizzando il solo tampone (blank solution) mentre Isample è la corrente che si ottiene analizzando il campione.

Prestazioni

In tabella sono riportati i valori di inibizione ottenuti con il biosensore per diversi erbicidi a diverse concetrazioni (10-6 ÷ 10-8 M)
Inibizione %*
Concentrazione (ppm) Diuron Ioxynil Cd2+
0.2 93 98 74
0.003 59 41 12
*RSD%=10% Misure sul campo... Il sistema può essere facilmente integrato con una strumentazione portatile ed essere quindi impiegato per analisi sul campo. Il biosensore risulta un utile strumento per l'analisi rapida di screening.

Biosensori per la determinazione rapida (POCT) della celiachia e delle allergie – BIO.A.CE
Finanziato da: Filas – Regione Lazio
Partenariato: RADIM s.p.a. e Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche – Università di Roma Tor Vergata
Progetto: L’allergia e il morbo celiaco sono malattie immunomediate tra le più comuni nei paesi occidentali, con una prevalenza nella popolazione generale che varia dal 10 al 30 % per l’allergia e dallo 0.3 al 1% per la celiachia. Tuttavia, un importante problema comune sia all’allergia che alla celiachia è la sottostima del numero di persone realmente affette dovuta ad una mancata o non corretta diagnosi. Per soddisfare tale esigenza, l’obiettivo di questo progetto è stato lo sviluppo di sistemi d’analisi rapidi, il meno possibile invasivi (data l’età spesso

pediatrica dei pazienti coinvolti), mirati a una diagnosi preliminare di screening e da poter essere utilizzati anche nel “doctor office” e/o in strutture non ospedaliere, diventando un “point of care testing” (POCT). I soggetti attuatori del progetto si sono occupati della messa a punto di test elettrochimici rapidi e sensibili per la diagnosi del morbo celiaco e delle allergie, rilevando i marcatori anticorpali (IgA anti-tTG) sia sul classico campione di siero che su campioni di saliva per quanto riguarda i test per la diagnosi della celiachia, e IgE allergene specifiche in campioni di siero per la diagnosi delle allergie. I sistemi sviluppati sono adatti ad analisi in sedi decentrate nel Point Of Care Testing e nel Doctor Office.

Risultati principali del progetto sono stati:


– Sviluppo di un immunosistema rapido a rivelazione elettrochimica per la diagnosi del morbo celiaco in campioni di siero. Valutazione dei parametri analitici (LOD, LOQ, sensibilità, specificità, esattezza, precisione) e clinici (sensibilità e specificità cliniche pari rispettivamente al 100% e al 98,36%) del metodo e validazione tramite analisi di 107 campioni reali di siero. Studio di correlazione del metodo con un sistema ELISA di riferimento.
– Sviluppo di un immunosistema elettrochimico qualitativo per diagnosi della celiachia in campioni di saliva non diluita. L’utilizzo della saliva e la rapidità del saggio (due incubazioni da 30 minuti) rendono il sistema sviluppato particolarmente adatto all’utilizzo in studi di screening di popolazione. Validazione del metodo proposto tramite misura di 92 campioni reali di saliva in cieco, e calcolo dei parametri di specificità (89%) e sensibilità (90%) cliniche.
– Sviluppo ed ottimizzazione di un immunosaggio a rilevazione elettrochimica per la diagnosi rapida delle allergie su campioni di siero umano con ottimizzazione del format di dosaggio delle IgE specifiche per 2 allergeni inalanti: G5 (Lolium perenne) della famiglia delle graminacee e D2 (Dermatophagoides farinae), acaro della polvere. Dosaggio delle IgE G5 e D2 specifiche in campioni reali di siero I risultati ottenuti sono concordi con la classe di allergia indicata.
– Utilizzo di un’economica strumentazione portatile con un software di gestione e analisi dei dati realizzato appositamente.
Il test sviluppato per la diagnosi della celiachia in campioni di siero ha permesso di ottenere eccellenti performance analitiche e diagnostiche, con prestazioni equiparabili ai test ELISA attualmente in commercio, ma con tempi di esecuzione più rapidi e utilizzo di una strumentazione portatile dai costi contenuti. Il saggio per la diagnosi della celiachia in saliva si configura come una notevole innovazione. Un unico efficace metodo disponibile in letteratura permette di ottenere migliori performance analitiche, ma con tempi di analisi più lunghi e uso di reagenti radioattivi che necessitano di laboratori attrezzati e di specifici permessi. L’immunosistema per la diagnosi della allergie, caratterizzata da una elevata sensibilità analitica, si inserisce nel mutevole panorama dei kit diagnostici per queste patologie. Vi è, infatti, una crescente domanda di test sempre più sensibili in grado di individuare le genesi allergiche sul nascere e quindi rendere più efficaci i trattamenti.

PRODOTTI INNOVATIVI PER IL MONITORAGGIO E LA DECONTAMINAZIONE/DETOSSIFICAZIONE DI AGENTI NERVINI ED ESPLOSIVI NELL’AMBIENTE E/O PER LA GESTIONE DELLE EMERGENZE

PROGRAMMA DI RICERCA E SVILUPPO
Obiettivo generale del progetto L’obiettivo generale del progetto, attraverso l’applicazione di approcci innovativi biotecnologici, chimici e ingegneristici, le cui competenze saranno fornite dalle unità co-proponenti e i consulenti, è di ottenere conoscenze che possano essere utilizzate per affrontare problemi di notevole interesse dal punto di vista sociale ed economico nell’ambito della sicurezza del cittadino, la gestione di emergenze e la preservazione delle risorse ambientali. Fondamentale è infatti la possibilità di un biomonitoraggio accurato delle infrastrutture sensibili come aeroporti, metropolitane, musei, supermercati, cioè luoghi chiusi ed affollati che ben si prestano allo scopo di attacchi terroristici con armi chimiche di distruzione di massa. Una classe di sostanze di questo tipo è rappresentato dagli organofosfati (OF) triesteri che attaccano prevalentemente il sistema nervoso bloccando l’acetilcolinesterasi un enzima chiave nel sistema nervoso e neuromuscolare. Sono OF sia i tristemente famosi gas nervini (soman, sarin, tabun,VX), sia i comuni pesticidi utilizzati dagli agricoltori di tutto il mondo (parathion, malathion, ecc.). Biosensori e decontaminanti per questi agenti nervini hanno l’interessante caratteristica di essere tecnologie duali con applicazioni sia civili che militari. In ambito civile l’interesse è per la sicurezza dei cittadini rispetto ad eventi non convenzionali (sia atti terroristici che incidenti industriali) ma anche per il routinario monitoraggio ambientale (acque e suoli) considerando che acqua, catene alimentari e animali possono essere anch’essi target di atti terroristici. Inoltre sistemi di detossificazione sono richiesti per la distruzione dei depositi di gas nervini e dei pesticidi obsoleti. Parecchi sistemi di rilevazione basati su componenti biologici (anticorpi, enzimi, acidi nucleici) sono stati proposti e validati nell’ambiente controllato di laboratorio. Tuttavia, nelle condizioni operative reali ci si deve confrontare con problemi ingegneristici di varia natura. In particolare si è trovato difficile mantenere i componenti biologici attivi in campo per settimane o mesi. Le fosfotriesterasi (PTEs) enzimi che possono degradare gli OF, sono ben note e studiate da decenni negli USA allo scopo di produrre biosensori e formulazioni per la detossificazione. L’enzima più studiato è la PTE da Pseudomonas diminuta che nonostante presenti un elevato turnover catalitico, prossimo al limite di controllo della diffusione, è un enzima non particolarmente stabile. Recentemente, il gruppo del responsabile del progetto ha clonato, overespresso e caratterizzato tre enzimi PTE-like termostabili. Questi enzimi sono ottimi candidati per sostituire la PTE di Pseudomonas grazie alla loro eccezionale stabilità. Sono stati già prodotti dei mutanti superattivi e con alterate proprietà (Manco G. e Rossi M. Brevetto Italiano Na2007A000005;). Sono altresì disponibili enzimi termostabili della superfamiglia esterasi/lipasi remoti omologhi della acetilcolinesterasi (Febbraio et al., Protein and Peptide Letters, 2009; Febbraio et al. Brevetto Italiano., Italian Patent NA2006A000010). Tali enzimi sono estremamente sensibili agli inibitori organofosfati e possono trovare impiego sia come biosensori che per la costruzione di “trappole” per agenti nervini. Sarà quindi sviluppata una tecnologia biosensoristica basata su enzimi stabili e/o particolarmente attivi o particolarmente specifici e per formulazioni di enzimi utili in diverse applicazioni. Si prevede quindi un forte impulso alla continuazione del lavoro per scoprire, ingegnerizzare/ottimizzare ulteriormente gli enzimi da utilizzare. Si prevede inoltre di ottimizzare la produzione su larga scala in pianta di tabacco e per fermentazione allo scopo di consentire applicazioni industriali. Parallelamente sarà anche sviluppata una tecnologia biosensoristica basata su acidi nucleici per la rilevazione dei residui genotossici e BWA (biological warfare agents) che sarà unita alla rilevazione di organofosfati, in un chip di rilevazione multifunzionale. Saranno sviluppati enzimi per la detossificazione/decontaminazione sia di OF che di altre sostanze che possano essere utilizzati per il rapido “restoring” delle condizioni ma anche per sviluppare sistemi di protezione individuale come maschere antigas e sistemi di bioremediation sia di acque che di suoli contaminati. Sarà infine sviluppata una tecnologia di controllo/trasmissione del segnale via wireless,, per avere in tempo reale informazioni sul tipo di attacco (contaminazione) e per l’attivazione delle opportune contromisure. Obiettivo finale Il progetto ha l’obiettivo finale di progettare, realizzare e validare un sistema che associ il segnale wireless di uno (o più) biosensori a una postazione centrale di ricevimento che attivi le contromisure di decontaminazione. Il raggiungimento dell’obiettivo finale avverrà secondo le modalità descritte di seguito: Identificazione di enzimi candidati stabili già disponibili o da isolare ex novo o da modificare mediante ingegneria proteica per la realizzazione di biosensori specifici contro agenti nervini (gas nervini e comuni pesticidi organofosfati), esplosivi e genotossici. Identificazione di enzimi candidati stabili già disponibili o da isolare ex novo o da modificare mediante ingegneria proteica per la realizzazione di formulazioni detossificanti/decontaminanti ad ampia specificità (realizzabile anche con più enzimi) per OF ed esplosivi. Preparazione e caratterizzazione di nuovi biosensori singoli e multipli che consentano non solo la detection generica ma anche l’identificazione dell’agente se sono disponibili diversi enzimi specifici. Preparazione e caratterizzazione di nuove formulazioni per detossificazione/decontaminazione che agiscano in pochi minuti o secondi (anche in questo caso si può pensare ad un pool enzimatico). Preparazione e validazione “in campo” di sistemi binari (biosensore/attuatore) per l’attivazione di contromisure in caso di eventi non convenzionali.  Problematiche di R&S Il successo del progetto è basato sul positivo sviluppo dei seguenti punti: Possiamo utilizzare i potenti mezzi di evoluzione molecolare in vitro e di ingegneria proteica per migliorare la performance di esterasi/OF idrolasi/altri enzimi in specifiche reazioni (idrolisi, riconoscimento) come procedura alternativa allo screening di batteri? È possibile trovare nuovi enzimi stabili e attivi per gli scopi del progetto mediante approcci di metagenomica vale a dire clonaggio dei geni codificanti per gli enzimi di interesse da microrganismi non coltivabili in lab ma adattati a crescere in condizioni estreme sia chimico/fisiche che per la presenza di sostanze tossiche Possiamo sviluppare prototipi di biosensori capaci di rilevare ed eventualmente identificare differenti agenti nervini, esplosivi e genotossici? È possibile produrre formulazioni di enzimi e modi di applicazione che permettano di degradare gli agenti tossici rapidamente sul campo? Gli enzimi destinati alla decontaminazione e detossificazione possono essere prodotti su scala industriale e a basso costo? I prototipi prodotti saranno operativi in condizioni reali? Gli enzimi selezionati sono già disponibili e se si, sono protetti da brevetti? È possibile la realizzazione di un sistema in grado di rilevare e identificare un segnale di pericolo e attivare in tempo reale le opportune contromisure? Sintesi del programma di R&S Risponderemo a questi quesiti attraverso lo sviluppo di 5 Obiettivi realizzativi (OR) principalmente di ricerca industriale. (OR1-5) con componenti minori di sviluppo sperimentale. Nella attività OR1.2 useremo tecniche avanzate di modificazione genica (directed evolution) per migliorare la specificità, la stabilità e selettività di enzimi candidati già disponibili e impiegheremo i nuovi enzimi per lo sviluppo di processi e strumenti orientati alla sicurezza dei cittadini e dell’ambiente. La risposta al punto b) consentirà l’identificazione di nuove idrolasi stabili per la degradazione di OF ed esplosivi nonché enzimi con differente specificità e sensibilità. Questo obiettivo del progetto vedrà l’impiego dell’approccio metagenomico sviluppato nella attività. OR1.1. Il successo del progetto dipende molto dall’esito positivo dell’ OR1 che si svolgerà all’IBP-CNR. La disponibilità di vari enzimi e mutanti già brevettati in Italia o per cui si è richiesto il brevetto rappresenta tuttavia un buon punto di partenza. Il successo della proposta dipende anche molto dalla capacità che avremo di esprimere gli enzimi in gran quantità a basso costo un risultato che si cercherà di ottenere mediante ottimizzazione dell’espressione in sistemi eterologhi ed in particolare per espressione in pianta di tabacco. Tale risultato consentirebbe anche la riconversione delle colture di tabacco verso altre finalità più rispettose della salute dell’uomo con evidente vantaggio economico per le regioni dell’obiettivo convergenza dove tale coltivazione è molto diffusa. Nell’obiettivo realizzativo 2 si utilizzeranno diversi tipi di approcci per lo sviluppo di nuovi biosensori basati su enzimi che possano essere utilizzati per il monitoraggio sul “campo” di contaminazioni ambientali dovute a sostanze tossiche sia chimiche che biologiche di derivazione da incidenti industriali o da eventi non convenzionali. Si svilupperanno anche sistemi di intervento per la bonifica (detossificazione/decontaminazione) di tali agenti tossici, in particolare agenti nervini (pesticidi e gas nervini ù organofosfati). Questo aspetto prevede lo studio della particolare formulazione che gli enzimi devono avere per assolvere gli scopi che ci prefiggiamo. Gli enzimi dovranno essere in grado di funzionare in diverse situazioni ambientali: superfici di vario genere, interfaccia aria/acqua, soluzione acquosa in presenza di co-solventi e/o surfattanti. Questo studio sarà affrontato nell’ OR3 che in modo particolare prevede la immobilizzazione su filtri da utilizzare per scopi differenti. L’ultimo OR (OR5) è essenzialmente un tipo di attività dimostrativa e di sviluppo sperimentale in cui i prototipi prodotti e validati in laboratorio saranno testati anche sul campo nell’ambito di un sistema per la gestione delle emergenze e questo è propedeutico alla strategia fortemente orientata all’utilizzatore finale presente in questo progetto. Tutti gli OR saranno supportati da un OR amministrativo e di management (OR0) che si occuperà anche della divulgazione e del dialogo all’interno e all’esterno del progetto. In questo OR (OR0) rientra anche la gestione del progetto formazione. Le componenti di ricerca di ogni OR sono definite sulla base delle competenze dei gruppi partecipanti. L’intero piano di lavoro beneficerà della costante comunicazione e del periodico scambio di materiale e staff di ricerca tra i laboratori. Le unità operative sono strettamente connesse perché dipendenti l’una dall’altra e questo garantisce un networking ottimale e la disseminazione dei risultati.
Progetto NANOTREAT – Valutazione dell’impiego di nanoparticelle d’oro funzionalizzate per diagnostica e terapia dei tumori Sono terminate le attività di ricerca del progetto finanziato dalla Regione Toscana coordinato da Ecobioservices and Researches e svolto in collaborazione con il Dipartimento di fisiopatologia clinica della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università degli Studi di Firenze (UNIFI) e con l’Istituto di Fisica Applicata “Nello Carrara” del Centro Nazionale Ricerche (CNR), area di Firenze. Alla base del progetto vi è stata l’idea di funzionalizzare nanoparticelle d’oro (GNP) anisotrope (cilindriche) che presentano un forte assorbimento della luce nel rosso-vicino infrarosso, dove si ha anche la massima trasparenza dei tessuti biologici, ed eccitare le stesse nanoparticelle con radiazione laser per rilasciare energia in modo controllato e preciso con fini diagnostici e terapeutici in campo oncologico e chirurgico. La possibilità di utilizzare nanoparticelle laser-attivate e di cedere calore con risoluzione a livello subcellulare rappresenta una prospettiva straordinaria in medicina; risulta infatti estremamente interessante il potenziale straordinario di queste nanoparticelle in applicazioni diagnostiche, terapeutiche e biosensoriali, in particolare nell’ambito dell’identificazione e microchirurgia dei tumori. L’attività di NANOTREAT è stata quella di sviluppare, caratterizzare e produrre in piccole quantità necessarie alla sperimentazione GNP funzionalizzate (ovvero con rivestimenti che associano un’ulteriore funzione) da utilizzare per applicazioni cliniche minimamente invasive, quali la distruzione selettiva di cellule, il rilascio di farmaci all’interno di cellule, la diagnosi fotoacustica a livello cellulare, che possono risultare di grande interesse in campo oncologico e chirurgico. Per sviluppare il progetto sono state necessarie competenze interdisciplinari. Hanno infatti partecipato, oltre a Ecobioservices come capofila:
  • Istituto di Fisica Applicata-CNR: produzione e caratterizzazione delle nano particelle d’oro (GNP), modulabili in assorbimento per rientrare nella finestra ottica dei tessuti
  • Chimica-UNIFI : funzionalizzazione delle GNP con shell di opportuna composizione anche ai fini del “drug delivery”; studio di tossicità di metalli pesanti (oro) su cellule
  • Fisiopatologia Clinica-UNIFI: imaging ottico di cellule interagenti con le nano particelle funzionalizzate e non.
  • Farmacologia-UNIFI: studi di citotossicità delle nanoparticelle e dei composti dell’oro, a livello cellulare
  • Patologia Generale-UNIFI: studio dei meccanismi di apoptosi in cellule interagenti con le nano particelle. Funzionalizzazione delle GNP con oleonucleotidi antisenso
  • Chirurgia Generale-UNIFI: studi preliminari riguardo all’uso delle nanoparticelle in chirurgia oncologica: modello animale
Visti i risultati ottimali della ricerca si sta procedendo ad una prima sperimentazione in vivo su piccolo animale.

Titolo Progetto:Biosensor based instrumentation to be used in vineyards and wineries for fast and sensitive detection of Botrytis cinerea (grey rot) in grapes.

Acronimo: SAFEGRAPE

Finanziato da: FP7-SME-2007-2, Grant Agreement Number 232453

Partenariato:                    E.Begerow GmbH & Co.KG – Food and Beverage- Germany

Bodegas del medievo S.L.– Spain

Ecobioservices & Researches srl Italy

Vitis Top S.L.- Spain

German Wine Growers Association e.V.-  Germany

Labor SrL– Italy

Consorzio Interuniversitario Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi

- Italy

Forschungsanstalt Geisenheim  – Germany

UNIVERSIDAD DE LA RIOJA  - Spain

Il progetto SAFEGRAPE ha come scopo lo sviluppo del primo strumento semplice ed a basso costo per l’industria vinicola in grado di fornire una valutazione quantitativa e affidabile della presenza di infezione da Botrite nell’uva in un tempo molto breve. Lo strumento proposto è basato sull’impiego di un biosensore e di un sistema di analisi innovativi che consente l’utilizzo di una procedura di analisi precisa e molto veloce (meno di un minuto) compatibile con le procedure di controllo qualità utilizzate sull’uva prima della vendemmia (misura dell’acidità totale, del contenuto di zuccheri…).

Il nuovo metodo proposto per la determinazione della Botrite si basa si un processo cinetico veloce che coinvolge i componenti attivi del fungo uniti a un sistema di traduzione molto sensibile che consente di determinare i prodotti di reazione con limiti di rivelazione molto bassi. Questo sistema necessita di tempi di reazione molto brevi (ordine delle decine di secondi) ed è caratterizzato da una risposta lineare e una elevata sensibilità che consente di operare con elevati fattori di diluizione del succo d’uva, minimizzando le possibili interferenze e rendendo quindi semplice la preparazione del campione.